پلی مرفیسم ISSR و کاربرد آن در اصلاح نباتات (بخش دوم و پایانی)

کاربرد مارکرهایISSR

پتانسیل ادغام ISSR-PCR در برنامه‌های اصلاح نباتات فراوان است (جدول 2). در ادامه حوزه‌های اصلی کاربرد ISSR-PCR در گیاهان مختلف مورد اشاره قرار خواهند گرفت.

انگشت نگاری ژنومی

انگشت نگاریDNA، ابزاری مهم برای خصوصیت یابی ژرم پلاسم و بنیان شناسایی ارقام/هیبریدها/ منابع والدی و غیره در اصلاح نباتات و مدیریت ژرم پلاسم می‌باشد. پرایمرهای ISSR دو نوکلئوتیدی متصل به انتهای 5’ یا 3’، در مطالعات انگشت نگاری با تکرارپذیری بالا برای مدیریت کلکسیون ژنومی کاکائو بکار گرفته شده‌اند. ISSR ها، پلی مرفیسم کافی برای تمایز میان ارقام مختلف گل داوودی را نشان داده‌اند. همچنین، ISSR ها، امکان تمایز بین گیاهان حاصل از میکروسپور و گیاهان حاصل از کشت سوماتیک در کشت پرچم کتان، را در مراحل ابتدایی گیاهچه فراهم کرده‌اند.

تنوع ژنتیکی و آنالیز فیلوژنتیکی

ISSR ها بطور موفقیت آمیزی برای تخمین توسعه تنوع ژنتیکی در سطوح بین و درون گونه‌ای در گستره وسیعی از گونه‌های گیاهی، شامل برنج، گندم، ارزن انگشتی، سیب زمینی شیرین و بارهنگ، بکار گرفته شده‌اند. برتری ISSR-PCR بر دیگر تکنیک‌های مارکری در مطالعات مختلف مشخص شده است. برای مثال، مشخص شده که پرایمرهای SSR اتصالی، مفیدتر و تکرارپذیرتر از ایزوزایم‌ها، RFLPs و RAPDs در آنالیز تنوع ژرم پلاسم پرتقال سه برگی می‌باشند. ISSR ها در آنالیز تنوع در جنسEleusine، از نظر کیفیت و کمیت داده‌های حاصله، نسبت به RFLP و RAPD، مفیدتر بوده‌اند. بطور معنی داری، راندمان تکنیک در توصیف خصوصیات حتی در سطح واریته‌های یک گونه نیز مستدل بود. برای مثال، سه پرایمر متصل به 5’ توانستند 20 رقم Brassica napus را از یکدیگر تمایز دهند. ISSR، مارکر گزینش برای ارزیابی تنوع ژنتیکی در کاکائو، بازدانگان و حتی قارچ‌هاست. در مطالعه‌ای بر لوپین سفید، مشخص شد که در میان 10 پرایمر مورد استفاده، دو پرایمر برای شناسایی تمامی 37 مجموعه مورد مطالعه، کافی بودند. متشابها، 4 پرایمر برای تمایز 34 رقم سیب زمینی و سه پرایمر برای تمایز 16 ژنوتیپ توت قرمز کافی بودند. استفاده از چنین پرایمرهای مفیدی، هزینه، زمان و کار آنالیز تنوع را کاهش می‌دهد.

تکنیک‌های مارکری مختلف در مطالعات فیلوژنتیک بر پایه شباهت نسبی بکار گرفته شده‌اند. علیرغم راندمان و تکرارپذیری بالاتر مارکرهایISSR، آنها هنوز بطور گسترده استفاده نمی‌شوند. اما کاربرد آنها در حل مشکلات مرتبط به فیلوژنی برنج اهلی آسیایی، گندم، ارزن انگشتی، Vigna و گونه‌های Diplotaxis مفید بوده است. چشم انداز وسیعی از کاربرد این تکنیک قوی برای تعیین روابط بین گونه‌ای در بسیاری از جنس‌ها و تمایز جنس‌های مختلف در درون یک خانواده وجود دارد. بطور قابل توجهی، مارکرهای ISSR اختصاصی ژنوم/گونه‌ها در چهار جنس Oryza ،Lolium ،Festuca و Diplotaxis  گزارش شده‌اند که در شناسایی گونه‌ها مفید بوده‌اند.

نقشه یابی ژنوم

مارکرهایISSR نقشه یابی نشده اند اما می‌توانند برای اشباع نقشه‌های پیوستگی RFLP و SSR مورد استفاده واقع شوند. نقشه جو با 60 مارکر ISSR (با عنوان RAMPs در مطالعه مورد اشاره قرار گرفته است) که برای تمامی کروموزوم‌ها نقشه یابی شدند، اشباع شد. بسیاری از این مارکرها بین RFLP های خوشه‌ای، خوشه‌های RFLP پیرامونی، در بالای کروموزوم‌ها و بخصوص در مناطق با تراکم پایین مارکرRFLP، نقشه یابی شدند. در گندم‌های Einkorn، اما، نه مارکر ISSR در موقعیت‌های مارکر RFLP و یا نزدیک به آن، نقشه یابی شدند. ISSRs همراه با مارکرهای AFLP و RAPD در نقشه یابی ژنوم های اروپایی و ژاپنی صنوبر مورد استفاده قرار گرفتند. نقشه پیوستگی ژنتیکی Citrus با استفاده از 75 مارکر ISSR که در طول همه گروه‌های لینکاژی گسترده شده بودند، اشباع شد. همچنین نشان داده شد که میزان انحراف تفرق ISSRs نسبت به RAPDs پایین‌تر است. در سویا، 58 مارکر ISSR بر فراز 18 گروه لینکاژی RAPD/RFLP نقشه یابی شدند. پلی مرفیسم های CA توزیع جهت داری داشته و پلی مرفیسم های GA بطور تصادفی گسترده شده بودند.

برچسب زنی ژن (Gene tagging) و گزینش به کمک مارکر

مارکرهای DNA با پیوستگی نزدیک به صفات مهم زراعی در برنامه‌های کاربردی اصلاح گیاه، نقش دارند. در برنج، یک مارکر ISSR تولید شده بوسیله پرایمر (AG)8YC، به یک مارکر(STS) تبدیل شد تا امکان شناسایی ژن بازگرداننده باروریRf-1، فراهم شود. این مارکر همبارز می‌تواند برای مدیریت خلوص ژنتیکی بذر هیبرید مورد استفاده واقع شود. در نخود، دومارکرISSR، "مارکر UBC 855500 حاصل از پرایمر (AG)8YT و مارکر UBC 8251200 حاصل از پرایمر (AG)8T" با ژن مقاومت به نژاد 4 پوسیدگی فوزاریومی پیوستگی نشان دادند. مارکرهای نزدیکتر به ژن هدف بوسیله جایگزینی نوکلئوتیدهای متصل به انتهای 5’ یا 3’ حاصل شده‌اند. اخیراً، ISSR-PCR در شناسایی دو مارکر آللی غالب DNA، یکی پیوسته به فاز کوپلینگ و دیگری پیوسته به فاز ریپالژن یک لوکوس اصلیFgr، که نسبت فروکتوز به گلوکز در گوجه فرنگی را  تنظیم می‌کند، استفاده شده است. این محصولاتPCR، از دو واکنش ISSR-PCR با استفاده از (TC)8CC و (TC)8CG بعنوان پرایمر، حاصل شدند. دیگر صفت مهم در تولید بذر هیبرید برنج یعنی نرعقیمی ژنتیکی حساس به دما، با یک مارکر ISSR، به نام UBC 8551060، برچسب گذاری شد.

همچنین ISSRsبرای تولید مارکرهای اختصاصی صفت، اختصاصی ژن و اختصاصی گونه استفاده شده‌اند. در حین توضیح روابط فیلوژنتیک میان گونه‌های مختلف جنس Oryza، تعداد 87 مارکر اختصاصی جنس/ گونه شناسایی شدند. توالی اختصاصی 582 جفت بازی (bp) بین میکروستلایتی Festuca و توالی اختصاصی 1350 جفت بازی F.arundinacea ، پتانسیل استفاده بعنوان مارکرهای تاییدگر حضور ژنهای به شدت پیوسته با Festuca، را دارند. مشابها، با استفاده از ISSRs، مارکرهای اختصاصی نژاد در گروه‌های مختلف قارچ توسعه یافته‌اند.

تعیین تناوب موتیف  SSR

آنالیز ISSR، امکان درک سازمان(خوشه‌ای بودن یا نه)، تناوب و مقادیر پلی مرفیسم تکرارهای توالی ساده متفاوت در یک ژنوم را ارائه می‌کند. در برنج و گندم، پرایمرهای مبتنی بر تکرار توالی‌های ساده دو نوکلئوتیدی، حداکثر تعداد باندها را ارائه کرده و بنابراین استفاده از آنها نسبت به SSRs با واحدهای (نوکلئوتیدی) بزرگتر، معمول‌تر است. پرایمرهای مبتنی بر موتیف پلی (GA) متصل به3’ ، پنج برابر باندهای تولید شده بوسیله پرایمرهای مبتنی بر موتیف پلی(GT) را تولید کردند که نشان دهنده تناوب اندک یا عدم کلاستربندی موتیف (GT) است. با استفاده از ISSRs نشان داده شده که تکرارهای چهار نوکلئوتیدی در ژنوم های یوکاریوتی فراوان هستند و تترامرهای چهار نوکلئوتیدی AGAC و GACA در درون ژنوم گراس‌ها پخش شده‌اند. در Brassica نشان داده شده که بهبود قدرتمند مارکرهای ریزماهواره، با استفاده از پرایمرهای ISSR میسر است.

مطالعات در مورد انشعاب جمعیت‌های طبیعی

ثابت شده که مارکرهای بسیار متنوع ISSR هسته‌ای در آزمون فرضیه‌های انشعاب، اینتروگروسیون و سیستماتیک، مفید هستند. منشا هیبرید Penstemon clevelandi با استفاده از تنها 8 مارکر ISSRبروشنی نمایان شد. مشخص شد که جمعیت P. clevelandi یک پروفایل افزایشی از باندهای DNA دو گونه اجدادی پیشنهادی یعنی P.centranthifolius و P. spectabilis دارد. در طرف دیگر، جمعیت P. spectabilis فاقد پروفایل افزایشی باندهای والدین پیشنهادی بود. بنابراین P. spectabilis بعنوان منشا هیبرید P. clevelandi رد شد و در عوض، منشا آن به اینتروگروسیون ژنها و نه ژنوم یک گونه نزدیک، منتسب شد. سودمندی تکنیک ISSR در طیف وسیعی از امور در اکولوژی مولکولی در خانواده‌های گیاهی،Asteraceae Violaceae ،Brassicaceae ،Hippocastanaceae ،Orchidaceae ،Poaceae Scrophulariaceae و نشان داده شده است. تنوع بین و درون جمعیت‌ها می‌تواند با استفاده از مارکرهای چند لوکوسی پراکنده مانند ISSR مقایسه شود. با استفاده از مارکرهای ISSR نشان داده شده که میزان تنوع میان جمعیت‌های O. granulata مناطق مختلف(49 درصد)، بیش از میزان تنوع میان جمعیت‌ها (38 درصد) و یا درون یک جمعیت(12 درصد) حاضر در یک منطقه مشخص بوده است.

چشم اندازها

همچنانکه نیاز به حفظ مالکیت ژرم پلاسم ممکن است در آینده افزایش یابد، ISSRs نقش مهمی در حفظ حقوق واریته گیاهی، بدلیل بازده منحصر به فرد آن در تمایز گذاشتن حتی میان ژرم پلاسم‌های نزدیک، دارد. تا امروز، پلی مرفیسم بیشتری با استفاده از ISSRs نسبت به سایر پروسه‌های ارزیابی شناسایی شده است. در بسیاری از مطالعات تعیین وسعت پلی مرفیسم یا مقایسه سیستم‌های مارکری تنها یک خانواده از ISSRs، برای مثال پرایمرهای مبتنی بر تکرار توالی‌های سه یا چهار نوکلئوتیدی، مورد استفاده قرار گرفته‌اند. چنین تکرارهایی در مقایسه با پرایمرهای مبتنی بر دو نوکلئوتید اندک بوده و استفاده از آنها ممکن است به طبقه بندی دقیق کمکی نکند. همچنانکه اطلاعات بیشتر در مورد وقوع و توزیع موتیف های SSRدر دسترس قرار می‌گیرد، استفاده از پرایمرهایی که پوشش دقیق‌تر کل ژنوم را ارائه می‌دهند، میسر می‌شود. همچنین، ترکیبات متفاوت موتیف، نوکلئوتیدهای متصله به انتهای  و طول پرایمرها می‌توانند مورد استفاده قرار بگیرند. استراتژی‌ها برای تشخیص پلی مرفیسم اضافی می‌تواند شامل استفاده از ISSRs در ترکیب با پرایمرهای رپید یا AFLP در همان واکنش یا هضم برشی محصولات ISSR باشد. بنابراین، ترکیبات نامحدود موتیف و طول هر دو پرایمر و استفاده از آنزیم‌های برشی مختلف میسر است. انتخاب خوب پرایمرها، می‌تواند انگشت نگاری دقیق و بنابراین تخمین سریع تنوع ژنتیکی بویژه در مجموعه‌های بزرگ برای شناسایی مجموعه‌های مرکزی و الگوی توزیع جغرافیایی را میسر سازد.

این تکنیک محدودیت‌هایی نیز دارد، برای مثال همچون رپید، ممکن است قطعات با تحرک پذیری مشابه از مناطق غیرهمولوگ منشا بگیرند که این امر می‌تواند موجب انحراف در تخمین شباهت‌های ژنتیکی شود. طبیعت مولکولی پلی مرفیسم تنها در صورتی شناخته می‌شود که قطعات استخراج شده از ژل توالی یابی شوند. مارکرهای ISSR مرتبط به صفات زراعی مهم، توالی یابی شده و بعنوان مارکرهای STS در گزینش به کمک مارکر (MAS) استفاده می‌شوند. بنابراین یک احتمال جالب، استفاده از ISSRs بعنوان پروب برای هیبریداسیون موضعی(in-situ)، بمنظور نقشه یابی فیزیکی مکان‌های همولوگ کروموزومی، است. دیگر امتیاز استفاده از مارکرهای ISSR، لینکاژ آنها با لوکوس های SSR است. اگرچه ریز ماهواره‌ها خودشان احتمالاً غیرعملکردی و از نظر انتخاب خنثی هستند، اما به سبب پیوستگی با مکان‌های رمز کننده مشهور هستند، بنابراین ISSRs ممکن است مناطق غنی از ژن را علامت گذاری کنند.

این مطلب ترجمه ای از مقاله” Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding” نوشته Sarla et al.(2002) بود، جهت دانلود متن اصلی مقاله و منابع آن بر روی لینک زیر کلیک فرمایید:

http://s3.picofile.com/file/7491837846/ISSR.pdf.html

پلی مرفیسم ISSR و کاربرد آن در اصلاح نباتات (بخش اول)